新葡萄8883国际官网席鹏课题组与合作者在活细胞超分辨成像领域做出新突破,翻开了活细胞线粒体STED(Stimulated Emission Depletion Microscopy)长时程观察的新篇章。该工作开发了一种新型线粒体染料MitoESq-635,其饱和光强相较于传统的ATTO 647N降低3.4倍,有利于长时间STED超分辨成像。利用这一优势,该工作实现了对活细胞线粒体长达50分钟的活细胞动态观测,达到了35.2纳米的超高分辨率,观测到了线粒体聚合以及分裂的动态过程。该成果于7月24日在线发表在Nature子刊《自然·通讯》(Nature Communications)上。
线粒体是细胞的“发电厂”,其内部具有丰富的线粒体嵴用于ATP合成。由于它具有自己独立的DNA,其也经常被认为是远古细菌入侵细胞并形成共生关系的一种典范。同时,在癌症等疾病中,由于新陈代谢异常,线粒体嵴也呈现异常。然而,受到衍射极限的影响,传统显微镜只有300nm左右的分辨率,无法观测线粒体嵴这类细微结构。STED超分辨技术因其超高分辨率和较快的成像速度,适用于研究线粒体嵴结构。但是STED技术通常需要较高的光强实现超分辨,对于线粒体的毒性极高,且普通染料很容易被光漂白。该项目所研发的新型线粒体染料MitoESq-635有较低的饱和功率,实现相同的分辨率只需要相对更低的STED光强,降低了光漂白的效果;同时有较高的稳定性,能够长时间照射仍保有较强的荧光强度。共定位结果显示该染料能特异性标记线粒体。这些特性使得它成为活细胞线粒体长时间STED超分辨成像的最佳染料之一。
利用这一染料结合STED超分辨技术,该工作实现了三维切片STED成像,提供了丰富的线粒体三维立体信息。该技术的动态超分辨的观测能力,推动了对线粒体动态过程的定量分析。随着拍摄时间的增加,线粒体的宽度会逐渐变大,荧光强度会缓慢下降,图像分辨率也会下降。通过合理地定量分析找到了合适的STED照射光强,平衡了分辨率、信噪比、拍摄时间等几个方面的参数。
该项目清晰地观察到了线粒体聚合以及分离的过程,对比与普通共聚焦显微镜,该技术实现了35.2纳米的超高分辨率,清晰地看到了线粒体嵴的动态变化。同时观察到了线粒体聚合在一起,以及分离开来的动态过程,对线粒体形态学和功能变化的研究有着重要意义。对比电子显微镜的图片,该项目在动态成像的基础上观察到了类似的线粒体结构,也进一步验证了该技术的超高分辨能力。
新葡萄8883国际官网席鹏教授提到:成像技术的发展目标不外乎“清”,“快”,“深”,“活”(“轻快生活”)四个字,本项目正是在这四字方针的指导下,向“清晰”,“快速”,“深层”,“活体”这四个方面研究突破,实现了35.2纳米的超高空间分辨率,同时可以达到0.66秒每帧的较高时间分辨率,较深的三维切片成像,以及长达50多分钟的活细胞动态成像。
该工作的共同第一作者杨旭三是新葡萄8883国际官网毕业博士生(导师席鹏),目前在康奈尔大学进行博士后研究,共同第一作者杨志刚是深圳大学光电工程学院教授,共同一作吴朝阳是新葡萄8883国际官网博士生(导师席鹏)。共同通讯作者分别为:席鹏,屈军乐(深圳大学),杨志刚(深圳大学,共同一作),杨旭三(共同一作)。
图 活细胞线粒体STED长时程成像。(a)线粒体动态成像结果; (b)共聚焦和STED对比; (c)强度分布展现了35.2纳米分辨率
席鹏课题组近年来致力于超分辨技术的开发与应用,如:1) 综合利用上转换纳米探针的光子雪崩和交叉驰豫特性,实现了上转换低功率STED,将饱和光强降低两个数量级以上(Nature 2017);2) 利用反射驻波光场调控成功实现19 nm的STED超分辨成像,达到目前STED生物样品成像分辨率的最高纪录,并对细胞核孔和病毒丝进行成像 (Light 2016);3) 利用高斯-贝塞尔光场调控,将STED成像的轴向深度提升一个数量级(Laser Photonics Review 2016);4) 结合偏振与结构光实现荧光偶极子超分辨成像(Light 2016,Nature Communications 2019),并两次得到Nature Methods的研究亮点评价。这些工作为本工作奠定了坚实基础。
原文链接:https://www.nature.com/articles/s41467-020-17546-1